【摘要】糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開(kāi)始，分解α-1,4-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸鈉氧化，過(guò)量的次碘酸鈉酸化后析出碘，再用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計(jì)算酶活力。1g固體酶粉（或1ml液體酶），于40℃、pH值為4.6的條件下，1h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖，即為1個(gè)酶活力單位，以u(píng)/g（u/ml）表示。

【關(guān)鍵詞】 ????葡萄糖 ????淀粉酶 ???活力測(cè)定 ????酶活力

【引言】酶作為生物體內(nèi)催化劑，測(cè)定其活力是非常有必要的。不同種類(lèi)的酶的活力測(cè)定方法不同。按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分為α-淀粉酶和β-淀粉酶等。根據(jù)其催化產(chǎn)物的特點(diǎn)和現(xiàn)有測(cè)定方法規(guī)定酶活力單位為：每分鐘每克鮮重麥種所催化生成的麥芽糖毫克數(shù)，來(lái)對(duì)這兩種酶進(jìn)行有效的測(cè)定。兩種酶作用淀粉的方式不同。α-淀粉酶可隨機(jī)地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。β-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進(jìn)行水解，每次水解下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。淀粉酶催化產(chǎn)生的這些還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。用標(biāo)準(zhǔn)濃度的麥芽糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測(cè)定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。

一．實(shí)驗(yàn)原理：葡萄糖淀粉酶（糖化酶）在一定的條件下能水解生成葡萄糖，葡萄糖的醛基被弱氧化劑次碘酸鈉氧化。過(guò)量的碘用硫代硫酸鈉滴定。從碘的減少量計(jì)算葡萄糖的量，從而計(jì)算酶活力。

二．試劑與材料：

1.2%可溶性淀粉液：稱取可溶性淀粉2g，以少許蒸餾水調(diào)勻，侵入80ml的沸水中，繼續(xù)煮至透明狀，冷卻后，加水定容至100ml

2.PH4.6，0.1mol/L醋酸緩沖液：0.1mol/L蘇酸溶液與0.1mol/L醋酸鈉溶液等體積混合。

3.0.1mol/L碘液：稱取36g碘化鉀，溶于100ml蒸餾水中，加入14g碘，逐漸溶解，加3滴鹽酸，定容至1000ml

4.0.1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4g NAOH，用水溶解，定容至1000ml

5.1mol/L硫酸溶液。量取56ml濃硫酸，倒入適量水中，用水稀釋至1000ml

6.0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液：稱取25g硫代硫酸鈉，0.2g碳酸鈉，溶于1000ml煮沸冷卻后的水中，存于棕色瓶。放置一周后，用0.1mol/L重絡(luò)酸鉀滴定。

7.0.5%淀粉指示劑：稱取0.5g可溶性淀粉用少量水調(diào)勻。倒入80ml沸水中，繼續(xù)煮至透明，冷卻后，定溶100ml

三．實(shí)驗(yàn)步驟：

????1.吸取2%可溶性淀粉液10ml，加入PH4.6醋酸緩沖液5ml，混勻后于40℃水浴中預(yù)熱10min

2.加入酶液1ml，于40℃，反應(yīng)10min。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，沸水中煮10min，以終止酶反應(yīng)。

3.吸取上述反應(yīng)液5ml于碘量瓶中，加入0.1mol/L碘液5ml及0.1mol/L NAOH溶液5ml，混勻，于室溫下暗處放置15min，加入2mol/L硫酸酸化。

4.以0.5%可溶性淀粉液作為指示劑，用0.05mol/L硫代硫酸鈉滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。記錄0.05mol/L硫代硫酸鈉消耗的毫升數(shù)（A），以及空白試驗(yàn)消耗的硫代硫酸鈉毫升數(shù)（B）。

四．結(jié)果計(jì)算：

在上述條件下，每小時(shí)催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的酶量定義為一個(gè)酶力單位。

???????????????酶活力=（B-A）×c×90.05×16/5×60/10

式中，B=空白試驗(yàn)消耗的硫代硫酸鈉的毫升數(shù)（???ML）

??A=測(cè)定時(shí)消耗硫代硫酸鈉的毫升數(shù)（???ML）

??c=硫代硫酸鈉的摩爾數(shù)（???MOL）

???90.05為葡萄糖的毫克當(dāng)量

酶活力=

??????=

硫代硫酸鈉溶液的標(biāo)定。

準(zhǔn)確稱取0.1g重絡(luò)酸鉀，放入500ml碘量瓶中，加20ml水溶解，加1.8g碘化鉀，15ml2mol/L鹽酸溶液，混勻，蓋好，暗處反應(yīng)10min，加約200ml水稀釋?zhuān)⒓从?.05mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至淺黃色，加約1ml 5%可溶性淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，溶液呈綠色。

五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：

⒈酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)的總體思路應(yīng)該是什么？

答：沒(méi)活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中都是根據(jù)酶活力的大小與催化產(chǎn)物的量成正比來(lái)計(jì)算酶活力大小的。

⒉由上述總體思路認(rèn)為酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中最關(guān)鍵的設(shè)計(jì)應(yīng)該是什么？為什么？在該項(xiàng)設(shè)計(jì)中要注意什么？

答：在酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的有3點(diǎn)：測(cè)定酶促反應(yīng)初速度、在最適條件下測(cè)定酶促反應(yīng)速度以及底物濃度要遠(yuǎn)超酶量。因?yàn)樵诿复俜磻?yīng)初期，產(chǎn)物濃度隨反應(yīng)進(jìn)程成正比例增加，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物濃度的增加使逆反應(yīng)速度增加、生成產(chǎn)物會(huì)對(duì)酶活力產(chǎn)生抑制、部分酶分子失活，所以要準(zhǔn)確測(cè)定酶活力，應(yīng)該測(cè)定產(chǎn)物濃度隨時(shí)間呈線性增加時(shí)間段的速度；其次，要在最適條件下測(cè)定酶促反應(yīng)速度，酶的本質(zhì)一般是蛋白質(zhì)，過(guò)酸、過(guò)堿以及溫度過(guò)高都會(huì)使酶變性，而且，溶液中的離子種類(lèi)和離子強(qiáng)度對(duì)酶活性和酶溶解度都會(huì)有一定影響，應(yīng)該選擇適合的緩沖液。最后，酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，必須提供足夠的底物，是所有的酶處于飽和狀態(tài)。

3.酶促反應(yīng)的特點(diǎn)？規(guī)定酶活力單位的作用？酶活力單位想表征的內(nèi)涵是什么？其規(guī)定有什么特點(diǎn)？

答：酶促反應(yīng)的特點(diǎn)一是通過(guò)顯著降低反應(yīng)活化能，提高催化效率；二是對(duì)催化反應(yīng)具有高度專(zhuān)一性；三是酶促反應(yīng)條件溫和，可以在常溫、常壓和有水的條件下正常進(jìn)行；此外，在生物體內(nèi)，酶的活性受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)。規(guī)定酶活力單位可以表示酶催化能力即酶活性的大小。

酶活力單位想表征的內(nèi)涵是單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量。其規(guī)定特點(diǎn)為以酶促反應(yīng)產(chǎn)物的生成速度來(lái)間接反應(yīng)酶活力的大小。

4.所有酶活力測(cè)定方法中都有所謂的“對(duì)照管”的設(shè)計(jì)，為什么？其作用是什么？在對(duì)它的設(shè)計(jì)上有何特點(diǎn)？

答：對(duì)照管用于測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中酶量的變化，其設(shè)計(jì)特點(diǎn)就是在堿性條件下保持其活性。

????《酶工程》（第三版），郭勇編著，科學(xué)出版社，2009.

《現(xiàn)代生化技術(shù)》，郭勇編著，華南理工大學(xué)出版社1996.8（2006.12重印）