修飾性PEG常規(guī)基團(tuán)的作用及分子量確定

PEG修飾是一個使多肽或蛋白質(zhì)在治療或生物技術(shù)方面的效力得以提高的重要過程。當(dāng)PEG以適當(dāng)?shù)姆绞竭B接在蛋白質(zhì)或多肽上時，它能改變許多的特征，而主要的生物活性功能，如酶活性或特異結(jié)合位點(diǎn)，可以保留下來。

PEG修飾通過如下幾種途徑改善藥物的性能。首先，PEG連接在蛋白質(zhì)或多肽的表面上，提高了它的分子大小，并且它還能攜帶大量的水分子，一種PEG-蛋白質(zhì)因而增大了5～10倍。其次，PEG修飾使得以前不溶的蛋白質(zhì)不僅容易溶解，而且具有高度移動性。此外，PEG修飾可以減少腎臟對藥物的濾過作用，降低它的致熱原性，還可以減少蛋白酶對其的消解，通過保護(hù)分子免受人體免疫系統(tǒng)的攻擊來改善了它的輸送。同時，因為它逃避了人體防御機(jī)構(gòu)，因而在作用部位停留的時間就長得多，并使局部藥物濃度增高。

目前在國外上市的PEG-多肽(或PEG-蛋白質(zhì))產(chǎn)品有：Schering-Plough公司的PEG-Intron，于2001年1月22日由FDA批準(zhǔn)上市。它采用了Enzon公司開發(fā)的專利PEG技術(shù)。這種重組干擾素α-2b與一個12,000 dalton PEG分子連接，使其抗病毒活性和消除半衰期之間達(dá)到佳平衡。Enzon還有兩種已經(jīng)被FDA通過的PEG修飾蛋白商品：ADAGEN和ONCASPAR。ADAGEN用于缺失ADA而引起的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病（SCID）；ONCASPAR即PEG修飾的天冬酰胺酶（L-asparaginase），用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL），天冬酰胺酶需要隔天注射，而PEG修飾后可以一周注射一次，還可以減少過敏。

另外，羅氏公司生產(chǎn)的抗病毒性肝炎特效藥派羅欣，日前獲得了瑞士國際藥品管理署的銷售許可。瑞士權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)證是基于兩個國際多中心三期臨床試驗的結(jié)果，該試驗表明，每周注射一次派羅欣可以獲得長久的持續(xù)病毒學(xué)反應(yīng)，療效比標(biāo)準(zhǔn)干擾素高出許多。特別是對伴有肝硬化的難治性患者也有顯著的效果。它采用了Shearwater的PEG修飾技術(shù)，即運(yùn)用mPEG2-NHS作為活化PEG，分子量40,000 Dalton，而干擾素為19,000。另外，世界頭號生物技術(shù)公司Amgen公司開發(fā)的新藥SD/01已于去年年底上市。SD/01就是用PEG修飾的粒細(xì)胞集落刺激因子G-CSF，是Amgen公司的早期產(chǎn)品G-CSF的長效型。而G-CSF的99年銷售額是12.2億美元，2000年是12.6億美元，這就可以看出PEG產(chǎn)品的市場十分巨大。

PEG修飾GLP-1的意義

GLP-1是一種30個氨基酸長度的肽類激素。通常情況下，這種長度的肽類激素口服無效，需要注射或其他適合肽類藥物的給藥方式（如，肺部或頰內(nèi)給藥）與胰高血糖素相似，GLP-1易形成原纖維，因此十分難溶于水。最近有許多文獻(xiàn)報道GLP-1難于形成混合物，難于形成藥物。GLP-1的藥動學(xué)性質(zhì)更加大了這一難題。二肽酶IV迅速降解GLP-1，其產(chǎn)物不僅沒有活性，還可以充當(dāng)GLP-1受體的拮抗劑，產(chǎn)生相反的作用。同時，腎小球?qū)LP-1的濾過十分迅速。由于以上原因，GLP-1在人體中的半衰期十分短，靜脈注射只有1.5分鐘，皮下注射有1.5小時，都不適合用作藥物。針對以上不足，對GLP-1的修飾成為了研究的熱點(diǎn)。現(xiàn)在正處于臨床中的Novo Nordisk A/S公司開發(fā)的GLP-1都經(jīng)過了脂肪酸修飾，活力保持良好，半衰期可達(dá)12小時以上，完全可以做到每日給藥一到兩次。采用PEG修飾，不僅可達(dá)到同樣的效果，而且可以避免專利糾紛，且PEG修飾的技術(shù)更為成熟，修飾物的原料更易獲得。

另外，從技術(shù)上講，Lys是大多數(shù)PEG修飾選擇的位點(diǎn)，有許多類型的PEG可選擇。GLP-1具有兩個Lys，且均處于非活力部位，因此為修飾提供了很大的靈活性。

PEG化學(xué)

多肽的修飾項目包括PEG大小的確定，活化類型的確定，以及活化PEG的獲取；多肽的獲取；多肽修飾位點(diǎn)的確定，活性基團(tuán)的保護(hù)，連接反應(yīng)條件的控制，以及產(chǎn)品的表征。還包括多肽修飾物的活性測定和半衰期測定。

反應(yīng)位點(diǎn)的初步確定

對于多肽，依反應(yīng)類型分為對巰基、氨基等基團(tuán)的反應(yīng)，和對羧基的反應(yīng)。反應(yīng)中作為親核試劑的活性基團(tuán)有（依活性大小）：巰基、alpha-氨基、epsilon-氨基、羧酸酯和羥基。這個順序不是絕對的，還和pH等其他因素有關(guān)。巰基在蛋白質(zhì)中含量很少，而且經(jīng)常和活性中心有關(guān)，不適合作為PEG結(jié)合的位點(diǎn)。而羧酸酯活性不高，故氨基是PEG修飾的常用基團(tuán)。但是也有例外的情況，如氨基對多肽的活性有很大的影響時，那就要選擇羧基作為結(jié)合位點(diǎn)。所以究竟選擇何種基團(tuán)作為結(jié)合位點(diǎn)，要根據(jù)多肽的具體情況綜合考慮。

PEG活化類型的確定

PEG活化，即將末端的羥基轉(zhuǎn)化為活性基團(tuán)。根據(jù)修飾位點(diǎn)的不同一般分為兩類：針對氨基巰基等基團(tuán)的活化，和對羧基的活化。前者又分為烷基化活化和酰胺化活化，烷基化修飾產(chǎn)物不會改變氨基酸殘基的電荷。如果氨基的正電性對生物活性很重要的話，烷基化修飾將是一個好方法，但是反應(yīng)不是專一性不強(qiáng)。如環(huán)氧烷基PEG，反應(yīng)性差，專一性不強(qiáng)，多肽的羥基也可能與之反應(yīng)。另外就是酰胺化活化，重要的有hydroxysuccinimidyl esters(–OSu)和chloroformates or carbonylimidazole活化。–OSu對氨基有很高的反應(yīng)活性，后者由于活性不太高，但選擇性較好。–OSu是使用較早、也比較廣泛的活化方法，如SS-PEG和SC-PEG，以及它們的替代物SPA-PEG、SBA-PEG和BTC-PEG。

PEG分子量大小的確定

一般來說，分子量為5，000和12，000Dalton的PEG是比較常用的，具體的大小要根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽的大小及修飾的目的來確定。Schering-Plough公司的PEG-Intron，PEG是12KD，intron是19KD，而Roche則采用了40KD的分枝式PEG來修飾intron。對于3 KD的小肽，5 KD的PEG可能比較合適。

另外，當(dāng)氨基酸或是多肽出現(xiàn)在PEG和蛋白質(zhì)或多肽之間時，將會改變它們的某些特征，并且這種改變可能會有利于蛋白質(zhì)。一種情況是氨基酸通過氨基與PEG結(jié)合，使得羧基得到活化，易于和蛋白質(zhì)結(jié)合。這一類修飾中正亮氨酸是很有價值的。另一種情況是具有三功能基團(tuán)的氨基酸，它通過兩個功能基團(tuán)（通常為氨基）與PEG結(jié)合，剩下一個功能基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)合。這樣將形成一個傘狀結(jié)構(gòu)，它抵抗蛋白質(zhì)的消化，阻止抗體的結(jié)合，降低免疫原性。這種修飾方法還可以避免對活性位點(diǎn)的結(jié)合。

在PEG修飾過程中存在如下值得關(guān)注的問題：

一是在PEG方面。PEG作為一種人工合成的多聚物，具有多分散性，其分散值（Mw/Mn）可從小分子多聚物（3-5Kd）的1.01，到大分子的1.20（20Kd）。這對修飾工作是不利的。目前可用MALDI質(zhì)譜儀測量這個值。在修飾工作中，PEG一端一般被甲氧基化。但是，仍有1-10%的PEG二醇存在。我們在使用處理過的單甲氧基PEG之前，最好要檢驗它的純度。PEG二醇將會引起不期望的交叉連接。另外，PEG的分子量也會對修飾的多肽或蛋白質(zhì)的性質(zhì)有重要影響。多種例子證明，PEG分子量越大，多肽或蛋白質(zhì)的半衰期就越長，活性越低。

二是在修飾過程中，考慮到多肽及PEG的不穩(wěn)定性，反應(yīng)必須在溫和的條件下進(jìn)行。

三是對PEG連接反應(yīng)的表征。我們要確定PEG是否連接上和連接的數(shù)目，以及連在哪個氨基酸殘基上。前者可通過MALDI-TOF質(zhì)譜儀或凝膠層析（GPC）分析，后者可以通過對多肽的逐步水解來確定結(jié)合位點(diǎn)。PEG的數(shù)目以及修飾的位點(diǎn)對于多肽類藥物是很重要的，因此表征工作不可忽視。

四是副反應(yīng)問題，PEG在連接反應(yīng)中也有可能和酪氨酸、組氨酸殘基等不期望的氨基酸結(jié)合，如在EGF（表皮生長因子）的PEG修飾中，通過MALDI質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)多了一條PEG鏈，它就接在了酪氨酸殘基上。這也體現(xiàn)了表征工作的重要性。

修飾性PEG常規(guī)基團(tuán)

上海金畔生物科技有限公司提供以下系列產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)轉(zhuǎn)讓或技術(shù)合作，提供定制合成系列功能團(tuán)修飾性PEG衍生物或各種功能聚合物系列：

1.mPEG (單甲氧基醚PEG)(monomethoxypoly(ethylene glycol)) 或者mPEO (monomethoxypoly (ethylene oxide))
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH
能夠合成二醇含量很低的mPEG

2.mPEG-NH2(mPEG-胺基) mPEG-amide
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH2
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2-NH2
帶有伯胺端基的mPEG是一種非常有用的功能化高分子。在mPEG上的胺端基，對于酰化試劑的活性比羥基高，因此，它們很容易進(jìn)行還原氨基化反應(yīng)。應(yīng)用胺基的反應(yīng)活性，我們可以很方便的通過生成穩(wěn)定的化學(xué)鍵(如酰胺鍵，氨基甲酸酯鍵，脲鍵和仲胺鍵), 把另一些分子和其連接。它們可用于：
制備帶有生物活性化合物的配體；
多肽合成時的載體；
制備高分子接枝物和PEG涂層；
制備PEG糖蛋白配體；
3. mPEG-SS (mPEG-琥珀酰亞胺琥珀酸酯)( mPEG-succinimidyl succinate)
mPEG-SS是較早使用帶活性基團(tuán)的PEG，它的反應(yīng)活性較高，但是由于和PEG主鏈連接的是酯鍵，因此，在強(qiáng)堿或強(qiáng)酸條件下，酯鍵易斷裂水解，使活性基團(tuán)的含量下降。

4. mPEG-SC(mPEG-琥珀酰亞胺碳酸酯)( mPEG-succinimidyl carbonate)
mPEG-SC是目前最常用的帶活性基團(tuán)的PEG衍生物，它和蛋白偶合生成的氨基甲酸酯鍵比酯鍵要穩(wěn)定，現(xiàn)廣泛用于與藥物的偶聯(lián)反應(yīng)中。

5. mPEG2-NHS(mPEG2-N-羥基琥珀酰亞胺酯) (mPEG2- N-hydroxysuccinimde)
通過把mPEG偶聯(lián)到賴氨酸上得到含有羧基的雙臂mPEG2-COOH, 然后再與NHS活化后得到雙臂mPEG琥珀酰亞胺酯（mPEG2-NHS）。mPEG2-NHS具有許多優(yōu)點(diǎn)，其產(chǎn)物的支化結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生較大的分子體積，這樣它們就不大可能滲透到蛋白質(zhì)空間位阻大的區(qū)域。在和蛋白偶聯(lián)后，不需要太多的偶聯(lián)點(diǎn)便可使偶聯(lián)產(chǎn)物保留PEG所具有的特點(diǎn)。mPEG2試劑盡管其水解速率及與小分子的反應(yīng)速率比大多數(shù)NHS活性酯快，但與蛋白質(zhì)的反應(yīng)速率卻要慢一些。這是由于其較大的空間位阻的緣故，因此適當(dāng)延長和蛋白質(zhì)的反應(yīng)時間是必要的。

6. mPEG-SPA(mPEG-琥珀酰亞胺丙酸酸酯) ( mPEG-succinimidyl propionate)
PEG羧酸的NHS活性酯是最常用來與蛋白質(zhì)偶合的PEG衍生物。它能與蛋白質(zhì)上的賴氨酸的胺端基反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺鍵。mPEG-SPA主鏈中不含有酯鍵，因此穩(wěn)定性較高，其在PH等于8的水溶液中的半衰期為16.5分鐘，大大高于mPEG-SS的9.6分鐘。

7. mPEG-ALD (mPEG-丙醛) ( mPEG-aldehyde)
在硼氫化鈉存在下，帶醛基的PEG會和伯胺發(fā)生還原氨化反應(yīng)。醛基和其它的親電活性基團(tuán)不同，它只和胺基反應(yīng)。雖然醛基的反應(yīng)活性比NHS活性酯低，但是它具有反應(yīng)條件溫和(pH 6-9.5，6~24小時)，易于使PEG和蛋白質(zhì)或其它材料的表面連接。因此，在較低的pH下，mPEG-ALD會對蛋白質(zhì)的N端進(jìn)行選擇性反應(yīng)。其連接的穩(wěn)定性（通過還原反應(yīng)形成仲胺）對于制備固定化酶是極其重要的。用這種方式改性的蛋白質(zhì)，可以保留氨基和蛋白在溶劑中的帶電性，這對于保持蛋白質(zhì)的構(gòu)造和活性是非常重要的。通過氨基酸分析方法對蛋白質(zhì)水解物中的賴氨酸進(jìn)行定量分析，可以很方便地對這些偶合產(chǎn)物進(jìn)行表征。mPEG-ALD是蛋白質(zhì)N端PEG化的通用試劑。

8. mPEG-MAL(mPEG-馬來酰亞胺) ( mPEG- maleimide)
馬來酰亞胺和巰基的偶合是蛋白和多肽偶聯(lián)中的一個非常有用的反應(yīng)。這個反應(yīng)很特別，即使在其它功能基存在下，它也可以在溫和的條件下進(jìn)行。作為有活性端基的聚合物，mPEG-MAL已被用來合成具有確定結(jié)構(gòu)和生物活性的PEG-蛋白質(zhì)偶合物。mPEG-MAL也常用作聚合物試劑來選擇性誘捕含巰基的多肽。

9. HO-PEG-COOH(a-羥基-w-羧基聚乙二醇) (α-hydroxyl-PEG-ω- carboxyl)

10. mPEG-b-PS (聚乙二醇和聚苯乙烯的嵌段共聚物) (mPEG-block- polystyrene)；

11. mPEG-b-PI(聚乙二醇和聚異戊二烯的嵌段共聚物) (mPEG-block- polyisoprene)；

12. mPEG-b-PAN(聚乙二醇和聚丙烯腈的嵌段共聚物) (mPEG-block- polyacrylonitrile)；

13. mPEG-b-PCL(聚乙二醇和聚ε-己內(nèi)酯的嵌段共聚物) (mPEG-block- poly(ε-caprolactone))；

14. mPEG-b-PMMA(聚乙二醇和聚甲基丙烯酸甲酯的嵌段共聚物) (mPEG-block- poly(methyl methacrylate))；

15. PEG (雙羥基PEG)HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH (分子量分布<1.15)各種分子量均能提供；

16. HO-PEG-NH2(α-羥基-ω-氨基聚乙二醇) (α-hydroxyl-PEG-ω- amide)；

17.mPEG-羧基（mPEG-carboxyl），各種分子量的產(chǎn)品，其純度>95%。

18.mPEG-腈基 (mPEG- cyan)各種分子量的產(chǎn)品，其純度>95%。

19. mPEG3-COOH 和mPEG3-NHS；

20. 三臂PEG以及四臂PEG（端基均為羥基）各種分子量；

21.超支化的聚丙三醇hPG (hyperbranched poly(glycerol);

22.Y型結(jié)構(gòu)；

23.枝狀結(jié)構(gòu)；

24.各種分子量的超支化PEG.