PEG的修飾作用和PEG修飾方法
摘要：聚乙二醇修飾即PEG化，是將活化的PEG通過化學(xué)方法以共價鍵偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或多肽分子上。自Davis1977年首次用PEG 修飾牛血清白蛋白以來，PEG修飾技術(shù)廣泛應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)和多肽的化學(xué)修飾，多個PEG修飾藥物上市或在臨床研究中。 PEG修飾具有半衰期延長、免疫原性降低或消失、毒副作用減少以及物理、化學(xué)和生物穩(wěn)定性增強(qiáng)等。
關(guān)鍵詞:PEG(聚乙二醇)；修飾
高分子聚乙二醇（PEG）由于其毒性小、無抗原性、具有良好的兩親性，且生物相容性已獲FDA認(rèn)可，對蛋白質(zhì)的改造具有無可取代的優(yōu)勢。聚乙二醇化修飾技術(shù)通過共價鍵，將聚乙二醇與被修飾藥物耦聯(lián)，改善藥物的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性，這種技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)(肽類)、酶、抗體及小分子藥物。
聚乙二醇具有較廣的分子量分布，隨著平均分子量的不同，性質(zhì)也產(chǎn)生差異，當(dāng)分子量小于1000Da時，聚乙二醇是無色無臭粘稠的液體，高分子量的聚乙二醇則是蠟狀白色固體，固體聚乙二醇的熔點正比于分子量，逐漸接近67℃的極限。毒性隨分子量的增加而減少，小于400Da的 PEG在體內(nèi)會經(jīng)乙醇脫氫酶降解成有毒的代謝物，而分子量大于1000 Da的PEG經(jīng)過多年應(yīng)用于食品業(yè)、化妝品業(yè)和制藥業(yè)證明沒有毒性。
聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能夠與水形成氫鍵，因而具有良好的水溶性，同時又可溶于除乙醚、己烷、乙二醇以外的大部分有機(jī)溶劑。大多數(shù)蛋白質(zhì)經(jīng)聚乙二醇修飾后，除保留或增加其水溶性外，還可以獲得在一些有機(jī)溶劑中的溶解性。在蛋白質(zhì)溶液中，聚乙二醇無論是處于游離還是結(jié)合形式，即使?jié)舛群芨撸瑢Φ鞍踪|(zhì)分子都沒有副作用。聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)一般構(gòu)象不會改變，其結(jié)合物的生物學(xué)活性主要由結(jié)合物的蛋白質(zhì)部分產(chǎn)生。
聚乙二醇具有免疫學(xué)惰性，即使分子量高達(dá)5.9×106Da，本身的免疫原性也很低。臨床上使用聚乙二醇修飾蛋白治療未發(fā)現(xiàn)抗聚乙二醇抗體產(chǎn)生。
在20種構(gòu)成蛋白質(zhì)的常見氨基酸中，只有具有極性的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)才能夠進(jìn)行化學(xué)修飾。常用的反應(yīng)氨基酸包括賴氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基。這些氨基酸殘基上的反應(yīng)性基團(tuán)多呈親核性，其親核活性通常按下列順序依次遞減：巰基>?氨基>?氨基>羧基(羧酸鹽)>羥基。根據(jù)化學(xué)修飾劑與蛋白質(zhì)之間反應(yīng)性質(zhì)的不同，修飾反應(yīng)主要分為酰化反應(yīng)、烷基化反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、芳香環(huán)取代反應(yīng)等類型，對蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基、巰基和羧基等側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾。巰基通常存在于蛋白質(zhì)的二硫鍵和活性位點上，而羧基如果不與蛋白質(zhì)上的氨基發(fā)生分子間或分子內(nèi)中和反應(yīng)，也很難活化。因此，蛋白質(zhì)或多肽分子最容易與修飾劑發(fā)生作用的位點是分子表面賴氨酸殘基上的氨基，包括?氨基或?氨基。
聚乙二醇修飾又稱分子的PEG化（PEGylation），是20世紀(jì)70年代后期發(fā)展起來的修飾方法。將活化的聚乙二醇與蛋白質(zhì)分子相偶聯(lián)，影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)各種生物化學(xué)性質(zhì)的改變：化學(xué)穩(wěn)定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，體內(nèi)半衰期延長，血漿清除率降低等。
1 PEG化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)
1.1 PEG化學(xué)結(jié)構(gòu)
結(jié)構(gòu)式CH2（OH）-（CH2CH2O）n -CH2OH
1.2 PEG性質(zhì)【1】
聚乙二醇系列產(chǎn)品通常情況下溶于水和多種有機(jī)溶劑，不溶于脂肪烴、苯、乙二醇等，不會水解變質(zhì)，有廣泛的溶解范圍和優(yōu)良的相容性、很好的穩(wěn)定性、潤滑性、成膜性、增塑性、分散性等。系低毒物質(zhì)，且無刺激性，屬非離子型聚合物。
2 聚乙二醇修飾劑
根據(jù)化學(xué)修飾劑與蛋白質(zhì)之間反應(yīng)性質(zhì)的不同，修飾反應(yīng)主要分為酰化反應(yīng)、烷基化反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、芳香環(huán)取代反應(yīng)等類型，對蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基、巰基和羧基等側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾。根據(jù)被修飾化合物包括蛋白質(zhì)、多肽、單克隆抗體分子片段、以及小分子化合物等的不同分子量大小、分子結(jié)構(gòu)以及其理化特性，公司采取不同的聚乙二醇化技術(shù)方法對這些化合物進(jìn)行修飾【2,3】。
2.1隨機(jī)修飾
隨機(jī)修飾蛋白質(zhì)多以賴氨酸的ε-NH2或α-NH2為修飾目標(biāo)，由于賴氨酸在蛋白質(zhì)內(nèi)通常數(shù)量較多，這種修飾引起蛋白質(zhì)中多個賴氨酸被修飾，得到的產(chǎn)物是聚乙二醇化修飾異構(gòu)體的混合物，目前FDA批準(zhǔn)的已經(jīng)上市的聚乙二醇化新藥多數(shù)為隨機(jī)修飾的產(chǎn)物。
2.2定點修飾
聚乙二醇化定點修飾，是在隨機(jī)修飾的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第二代聚乙二醇修飾技術(shù)，通過對修飾方式、PEG修飾劑和反應(yīng)pH等的優(yōu)化選擇，實現(xiàn)定點修飾，這種修飾所得的產(chǎn)物為均一產(chǎn)物，異構(gòu)體少，活性保留較好，免疫原性大大降低。
2.2．1?N端氨基定點修飾
由于蛋白質(zhì)、多肽中存在多個α-NH2 和ε-NH2基團(tuán)，氨基的隨機(jī)修飾可能導(dǎo)致藥物活性的明顯下降，這給蛋白質(zhì)、多肽的修飾帶來了障礙。目前我們采取對N端氨基定點修飾，特別是對于遠(yuǎn)離活性中心的 N端定點修飾可以有效地保持藥物的原有生物活性。
2.2.2巰基定點修飾
結(jié)合基因工程技術(shù)或Mutagenesis等方法，將巰基或一些特異性基團(tuán)引入到蛋白、多肽預(yù)設(shè)位點（如不影響活性的糖基化位點、抗原決定簇等）后，再進(jìn)行對該基團(tuán)的修飾，這樣就可得到活性保留較高和免疫原性降低的定點修飾產(chǎn)物。
2.2.3羧基定點修飾
采用帶酰肼活化基團(tuán)的聚乙二醇衍生物對蛋白質(zhì)、多肽進(jìn)行羧基基團(tuán)進(jìn)行修飾， 同樣可以獲得定點的修飾產(chǎn)物。
2.2.4酶催化修飾
采用酶催化手段誘導(dǎo)聚乙二醇分子與蛋白質(zhì)、多肽等分子上特定的位點進(jìn)行定向修飾。此方法具有一下特點：1）不需要對原蛋白質(zhì)、多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，保持原化合物的理化特性不受改變；2）定點修飾；3）工藝簡單，容易大規(guī)模化生產(chǎn)和質(zhì)量控制。
3 PEG修飾對蛋白質(zhì)的影響
3.1 增加溶解度和穩(wěn)定性
藥用PEG易溶于水和大多數(shù)極性溶劑，不溶于脂肪烴類、苯和礦物油等非極性溶劑【4】。隨相對分子質(zhì)量升高，起在急性溶劑中的溶解度逐漸下降。由于PEG共價連接蛋白質(zhì)等高分子后，其天然構(gòu)象產(chǎn)生一定的剛性，不易伸展失活，減少了分子內(nèi)部基團(tuán)的熱震動，從而增加了熱穩(wěn)定性。
3.2 減少免疫原性和抗原性，降低毒副作用
消除或降低蛋白質(zhì)等高分子的抗原性效果明顯【5】。L-天門冬酰胺酶用PEG修飾后可消除抗原性。
3.3 延長血漿半衰期和增加體內(nèi)系統(tǒng)暴露
許多蛋白質(zhì)等高分子經(jīng)PEG 修飾后，抗蛋白水解酶、抗抑制劑等失活因子的能力和熱穩(wěn)定性提高，其體內(nèi)半衰期比天然蛋白質(zhì)等高分子長，對提高蛋白質(zhì)等高分子的藥用療效極具意義【6】。L- 天門冬酰胺酶經(jīng)PEG 修飾后，體內(nèi)半衰期可延長13 倍。
一些蛋白質(zhì)等高分子經(jīng)PEG 修飾后可改變組織的分布能力，能在血液中被靶器官選擇性吸收【7】。
3.4 增加體內(nèi)生物活性和療效
一些PEG 修飾后的蛋白質(zhì)等高分子抗蛋白水解酶水解、抗抑制劑、抗酸堿和有機(jī)溶劑等變性失活能力提高【8】。原因是PEG 所產(chǎn)生的空間屏蔽阻擋了失活因子的進(jìn)攻。此外，蛋白質(zhì)等高分子中對蛋白水解酶等失活因子敏感基團(tuán)被修飾，使其能力提高。過氧化氫酶經(jīng)PEG 修飾后，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解能力明顯提高。
3.5 減少給藥次數(shù)，降低病人痛苦
PEG 可使大多數(shù)蛋白質(zhì)等高分子毒性減少，且本身無毒性(相對分子質(zhì)量>1 000)，相對分子質(zhì)量為4000 的PEG 可按每千克體重16g 的劑量，以10%的溶液安全地注射入鼠、兔、猴等動物體內(nèi)【9,10】，不傷害蛋白質(zhì)和細(xì)胞【11】。
4 PEG 修飾的應(yīng)用
化學(xué)藥物或蛋白質(zhì)藥物等在產(chǎn)生作用的同時，一般都存在自身無法克服的問題； 如較短的作用周期，較大的抗免疫原性及毒副作用。聚乙二醇化技術(shù)是一種將聚乙二醇活化后鏈接到藥物分子或藥物表面的技術(shù)。聚乙二醇可以增加藥物的水溶性，降低毒副作用，減少免疫原性，提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，同時延長藥物循環(huán)半衰期。
4.1尿激酶(UK)
尿激酶主要是相對分子質(zhì)量為31 300 和54 700的高分子物質(zhì)。尿激酶是一種堿性蛋白酶，由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人及哺乳動物的尿中，人尿平均含量5~6 U/ml。尿激酶也具有酯酶活力，目前已廣泛應(yīng)用于治療各種心血栓和血栓梗塞疾病【12】。
4.2 PEG的活化及對殼聚糖的修飾作用
用聚乙二醇 (ＰＥＧ)修飾殼聚糖可望使二者的優(yōu)良性質(zhì)得到有利結(jié)合。提高殼聚糖作為生物醫(yī)學(xué)工程材料的生物相容性 ,改進(jìn)吸附性能等重要作用。ＰＥＧ末端羥基可以進(jìn)行多種活化【13】。
4.3人紅細(xì)胞生成素(EPO)
沈富兵等【14】研究了PEG化重組人紅細(xì)胞生成素(在動物體內(nèi)的作用。經(jīng)動物皮下注射后比較PEG化重組人紅細(xì)胞生成素與普通人紅細(xì)胞生成素在網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、用藥頻度、腎性貧血糾正及對病模動物的保護(hù)作用。表明PEG化重組人紅細(xì)胞生成素網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)升高持續(xù)時間可達(dá)7 d 以上，而普通人紅細(xì)胞生成素組只能達(dá)到4 d ；在周劑量(0.08 μg/ 只)相同的條件下，PEG化重組人紅細(xì)胞生成素 每周給藥1 次，小鼠紅細(xì)胞比容(HCT)增高15.3%，與普通人紅細(xì)胞生成素每周給藥3 次的HCT 增高13.4% 的效果相當(dāng)，而與普通人紅細(xì)胞生成素每周用藥1 次的HCT 增高6.0% 有明顯差異。在病模大鼠的貧血治療實驗中，PEGEPO不僅每周1 次給藥能達(dá)到普通人紅細(xì)胞生成素每周3 次給藥的效果，而且對患病大鼠的死亡保護(hù)作用也遠(yuǎn)優(yōu)于普通人紅細(xì)胞生成素。說明PEG化重組人紅細(xì)胞生成素作用時間持久，用藥次數(shù)少，糾正貧血效果明顯，保護(hù)效果良好。
5結(jié)語
以上所述的以PEG 修飾的蛋白質(zhì)等高分子雖然具有一定的代表性，但僅僅是此方面的部分實例。相信隨著生物經(jīng)濟(jì)時代的來臨，以PEG 修飾蛋白質(zhì)等高分子將會得到更多的應(yīng)用，會為人類的健康和社會的進(jìn)步作出更大的貢獻(xiàn)。
PEG修飾方法—聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的活化與檢測方法
摘要 聚乙二醇共價修飾蛋白質(zhì)藥物可以消除蛋白質(zhì)藥物的抗原性及免疫原性 延長小分子
多肽在體內(nèi)的半衰期本文對該項技術(shù)最近的制備分離分析方法及各種方法的優(yōu)缺點作一介紹并對不同蛋白質(zhì)需采用的分析方法提出了一點建議。
關(guān)鍵詞聚乙二醇 修飾 活化 分離 分析
近年來隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展用于疾病治療的多肽酶細(xì)胞因子等蛋白類藥物越來越多地被研究開發(fā)這類藥物具有專一性強(qiáng)時效高等優(yōu)點但也有許多不盡人意的地方如(1)大多數(shù)藥物具有抗原性及免疫原性(2)容易從循環(huán)系統(tǒng)中被快速清除(3)定位給藥困難(4)不穩(wěn)定容易被酶類降解且來源稀少等[1] 為了克服基因工程蛋白類藥物的上述缺陷許多研究人員正設(shè)法對蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或化學(xué)修飾[2~4]
化學(xué)修飾法是指在分子水平上對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，即在體外將蛋白質(zhì)的側(cè)鏈基團(tuán)通過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價連接，從而改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。
? ? ? ? 其主要優(yōu)點是可以延長蛋白質(zhì)在體內(nèi)的半衰期、降低免疫原性和抗原性；另外還可以減弱蛋白酶的水解作用，增加蛋白分子的可溶性等。蛋白質(zhì)的免疫原性是由于其分子表面的抗原簇所決定的，應(yīng)用線性、親水、惰性的高分子與蛋白質(zhì)的非活性必需基團(tuán)結(jié)合，在其表面形成屏蔽，使其不被識別不產(chǎn)生相應(yīng)抗體，從而抑制相應(yīng)的免疫反應(yīng)；而連接大分子聚合物后，藥物的分子量顯著增大，不易被腎小球所過濾，從而延長在體內(nèi)的半衰期。另外，由于大分子親水性、聚合物的表面遮蔽作用在一定程度上減少了蛋白藥物與蛋白酶的相互作用，使藥物的穩(wěn)定性進(jìn)一步提高用于蛋白質(zhì)修飾的大分子，很多常見的有如下類型聚乙二醇(包括聚乙二醇PEG和單甲基聚乙二醇mPEG) 多糖類如葡聚糖、右旋糖酐、淀粉等同源蛋白質(zhì)及人工合成的多肽，如聚丙氨酸等，其中聚乙二醇由于其良好的生物相容性、反應(yīng)簡單、價格低廉等優(yōu)點，受到較多的重視[1] 本文著重介紹聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的活化方法分離純化及其分析方法等。
1 聚乙二醇的活化
聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)主要通過聚乙二醇的末端羥基與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基反應(yīng)而實現(xiàn)，但聚乙二醇的末端羥基活性很差，很難在溫和的環(huán)境中與蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，所以必須使用活化劑活化該羥基，使活化的聚乙二醇能在溫和的環(huán)境中對蛋白質(zhì)進(jìn)行共價修飾。近年來聚乙二醇的活化方法已成為該領(lǐng)域的研究熱點之一。
1.1 非特異性活化方法
1.1.1 溴化氰法?色譜或?qū)游龅墓滔噍d體最早的活化方法之一即溴化氰活化法 高pH 時溴化氰與載體內(nèi)部的羥基反應(yīng)轉(zhuǎn)化成氰酸酯和亞氨基碳酸酯后來該方法也應(yīng)用于帶羥基的高分子聚合物的活化其方法操作簡單容易重復(fù)而且反應(yīng)環(huán)境溫和但其偶聯(lián)后的配基(包括蛋白質(zhì)R-NH2)很容易脫落這種脫落主要是由于活化載體和含氨基配基之間形成不穩(wěn)定的異脲鍵所引起的[5] 加之溴化氰有毒操作須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行該方法逐漸被其它方法所取代。
1.1.2 羰基二咪唑法??該方法最早用于多肽的合成 被證明是形成酰胺鍵的良好試劑含羥基的載體可與羰基二咪唑(CDI)反應(yīng)得到活潑的酰基咪唑蛋白中賴氨酸殘基的伯氨基可與其迅速反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵這種化學(xué)鍵比較穩(wěn)定偶聯(lián)上的蛋白不易脫落[5]。
CDI 活化PEG 需注意(1)CDI 遇水生成CO2 和咪唑所以活化反應(yīng)宜在有機(jī)溶劑中進(jìn)行且溶劑不能含水(2)活化后的聚乙二醇最好在低溫下洗滌以保持高反應(yīng)活性(3)活化后的聚乙二醇應(yīng)用冷凍干燥法除去殘留的有機(jī)溶劑以免使偶聯(lián)的蛋白失效(4)偶聯(lián)蛋白質(zhì)的緩沖液中勿含有胺類(如Tris 或甘氨酸) 否則它將與待連接的蛋白分子競爭偶聯(lián)。
1.1.3 N-羥基琥珀酰亞胺法 (a)N,N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化此反應(yīng)也需要在無水條件下進(jìn)行。
(b)琥珀酸酐及N–羥基琥珀酰亞胺活化?該方法活化得到的聚乙二醇活性較高最好是在非水環(huán)境中進(jìn)行蛋白的偶聯(lián)但對于多數(shù)生物大分子來說都是優(yōu)先考慮水溶液系統(tǒng)而且在4°CpH=8 時活化聚乙二醇在水中的半衰期為20min 左右所以偶聯(lián)反應(yīng)最好在低溫下20min 內(nèi)完成，周笑艷等用該方法對天冬酰胺酶進(jìn)行修飾取得了較好的效果[4]
1.1.4 氰脲酰氯法??氰脲酰氯又名三氯化嗪(TST) 是對稱雜環(huán)化合物含有三個活性酰氯鍵廣泛應(yīng)用于染料行業(yè)TST 上的三個氯原子很容易發(fā)生親核取代反應(yīng)而且一個氯原子的取代可以穩(wěn)定其它酰氯鍵所以第一個氯原子在4°C 就可以反應(yīng)第二個在25°C 反應(yīng)第三個在80°C 才反應(yīng)David 等利用TST 與聚乙二醇上的羥基反應(yīng)只有一個氯原子被取代其它的氯原子與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)為抑制氯原子的親核活性以控制反應(yīng)的速度及修飾度可先加入苯胺取代其中一個氯原子剩下的氯原子用于蛋白質(zhì)的偶聯(lián)該反應(yīng)雖說簡單易行但由于TST的毒性以及鹵原子過強(qiáng)的親核活性使其應(yīng)用受到限制
1.1.5 光氣參與的活化方法??Kurfuerst 等在其專利中提到一些方法[6] 分別用N-羥基琥珀酰亞胺鉀鹽硝基苯酚及三氯苯酚與光氣反應(yīng)制備活化聚乙二醇活化主要分兩步如圖6 所示。
這些活化劑都應(yīng)與聚乙二醇在有機(jī)相反應(yīng)操作方法類似活化效果和配基偶聯(lián)效果還沒有具體評價但該反應(yīng)由于有光氣參與毒性極強(qiáng)增加了操作的復(fù)雜性。
1.1.6 改變聚乙二醇結(jié)構(gòu)以提高修飾效果改變聚乙二醇的結(jié)構(gòu) 將聚乙二醇的結(jié)構(gòu)由線狀改為叉狀或梳狀也可以起得到更好的修飾效果。
其優(yōu)點主要體現(xiàn)在
(1)叉狀聚乙二醇可以減少蛋白酶與蛋白質(zhì)的接觸以減弱其水解作用
(2)聚乙二醇結(jié)構(gòu)變化造成的空間位阻效應(yīng)減少了聚乙二醇與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點減少蛋白質(zhì)失活
(3)聚乙二醇對蛋白質(zhì)的屏蔽效應(yīng)更為顯著更好地降低蛋白藥物的抗原性和免疫原性
Schiavon 等用線狀和叉狀聚乙二醇分別修飾尿酸酶[8] 結(jié)果如表1
由表1 可以看出叉狀聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)可以很好地保留蛋白的生物活性，另外通過增長活化端與聚乙二醇鏈之間的距離或在a-C 上增加支鏈可以延長活化的聚乙二醇在水中的水解半衰期從而有望提高修飾效果如表2
經(jīng)PEG 修飾后的蛋白質(zhì)是十分復(fù)雜的混合物這是由于
(1)PEG 聚合物分子量分布較寬，如PEG5000 的分子量分布在5000 500 道爾頓范圍內(nèi)
(2)由于被修飾蛋白質(zhì)上待連接的活性位點的活性不同空間位阻不同導(dǎo)致每個蛋白分子上連接的PEG 數(shù)和PEG 連接的位置不同如超氧化物歧化酶(SOD)有20 個可能的PEG 連接位點理論上大約有2020 種不同的反應(yīng)產(chǎn)物
(3)活化的聚乙二醇中還殘留未反應(yīng)的活化劑未活化的mPEG 等因此經(jīng)PEG 修飾后的蛋白質(zhì)必須進(jìn)行分離純化一般用色譜方法純化PEG 化蛋白質(zhì)連接PEG 后蛋白質(zhì)的分子量有了不同程度的提高要想將其逐一分開體積排阻色譜(SEC)就成了首選的方法但SEC 分離同一數(shù)量級的物質(zhì)效果不好所以對于分子量小且修飾位點少的多肽和小分子蛋白質(zhì)該方法也不是很理想由于PEG為弱疏水性長鏈連接PEG 后蛋白質(zhì)分子的疏水性有所增強(qiáng)所以也可以用反相高效液相色
譜(RP-HPLC)分離但其分離條件的摸索較為煩瑣再者由于連接了PEG 蛋白質(zhì)分子上的氨基等活性位點減少其等電點pH 都發(fā)生了變化所以用離子交換色譜(IEC)理論上也可以將其分離Malik 等的研究表明PEG 化蛋白質(zhì)的純化難度很大且純化產(chǎn)量很低[10] Busby 和Ingham認(rèn)為分離難度大的原因在于PEG 在水溶液中具有伸展構(gòu)象其流體動力學(xué)體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于同樣分子量的蛋白質(zhì)例如mPEG6000 不能通過截留分子量為12KD 的半透膜在體積排阻色譜中PEG6000 的行為類似于分子量25 35KD 的球狀蛋白質(zhì)[11] 采用切割分子量為30000Da 或50000Da 的超濾膜過濾可有效去除mPEG 但該方法不適用于小分子多肽迄今為止常用的分離方法是先用超濾或透析去除咪唑等小分子活化劑殘余物然后再用
各種色譜法分離如 Snider 等用各種色譜法考察PEG-SOD 的多態(tài)性[12] Mcgoff 等用體積排阻色譜和離子交換色譜對PEG-SOD 進(jìn)行分離及分析[13] 唐微等先利用硫酸銨對反應(yīng)后的混合物進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀有效地去除了溶液中的PEG 然后再對離心出的蛋白質(zhì)進(jìn)行體積排阻色譜分離分離效果較以前好[11] 但該方法同樣也不適于小分子多肽因為小分子多肽不容易被鹽析沉淀另外Zhao 等用異丙醇沉淀活化后的聚乙二醇分子可有效去除反應(yīng)時的極性溶劑和副產(chǎn)物活化聚乙二醇的收率達(dá)90%以上[23]
PEG 化蛋白質(zhì)的檢測與分析至少應(yīng)該有三個方面(1)蛋白的平均修飾度(2)PEG 修飾的位點及特定位點被修飾程度(3)不同修飾度的蛋白質(zhì)的相對含量[14] 其中PEG 修飾的特定位點及特定位點被修飾程度的檢測目前尚未見報道現(xiàn)將幾種常用的檢測分析方法介紹如下。
3.1 色譜法
如果用色譜法可以將聚乙二醇反應(yīng)后的混合物逐一分離則可以繪制隨濃度變化的工作曲線根據(jù)工作曲線來為各個組分定性及定量從而確定混合物的平均分子量和平均修飾度但由于PEG 化蛋白質(zhì)的多樣性以及PEG 在溶液中影響蛋白質(zhì)的色譜行為色譜法分析并不是最好的分析方法其分辨率很低譜帶寬且包含多種混合成分另外由于蛋白質(zhì)的多樣性定性
及定量也會有困難Snider 等分別利用高效離子交換色譜高效體積排阻色譜高效反相液相色譜等對PEG-SOD
作分析結(jié)果顯示其分辨率很低不能將各種分子逐一分析譜帶寬且雜亂[12] Mcgoff 用體積排阻色譜對PEG 化的SOD 進(jìn)行分析SOD 為一尖銳的峰而PEG 化的SOD 則為一寬峰而且不能分離完全[13] 但對于修飾位點少的蛋白質(zhì)或多肽而言色譜法效果較好如Brian Fenton等用RP-HPLC 對PEG-Hirudin(水蛭素)分析由于水蛭素只有三個修飾位點其產(chǎn)物較少可以很清楚的看出有三個峰分別為PEG-Hirudin (PEG)2-Hirudin (PEG)3-Hirudin[15]凝膠滲透色譜(GPC)屬于凝膠色譜的一種凝膠色譜以多孔性填料為固相填料上有許多大小不一的孔徑據(jù)樣品的尺寸大小實現(xiàn)分離以有機(jī)溶劑(如甲苯四氫呋喃等)為流動相的稱為凝膠滲透色譜以水溶液為流動相的稱為凝膠過濾色譜有機(jī)相能很好的溶解大分子PEG Bullok 等用堿水解使蛋白質(zhì)與PEG 分離再對水解下來的PEG 進(jìn)行凝膠滲透層析通過測定PEG 的量以測修飾度[16] 但該方法可能因為水解不徹底和樣品中含有游離的PEG 而受干擾。
3.2 SDS-PAGE 凝膠電泳法
凝膠電泳是蛋白質(zhì)分析中十分常用的方法其分辨率高且可以測定分子量但該法在測定PEG 化蛋白質(zhì)的分子量方面卻存在很多缺陷由于PEG 在蛋白質(zhì)表面的屏蔽作用和PEG 分子與凝膠分子的纏繞作用使PEG化的蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移速度減慢測出的分子量偏大Kurfurst用常規(guī)的電泳法測定PEG 修飾后的水蛭素分子量結(jié)果比理論值大一倍以上用碘化鋇將PEG染色根據(jù)PEG 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定分子量其值要準(zhǔn)確的多Kurfurst 還用等電聚焦法分析PEG 修飾后的水蛭素證明有三種物質(zhì)Hirudin PEG-Hirudin (PEG)2-Hirudin[17]另外用毛細(xì)管區(qū)帶電泳對PEG 化蛋白質(zhì)的分析也屢見報道由于蛋白質(zhì)的疏水作用靜電作用和其它多種兩相分配機(jī)制毛細(xì)管中的蛋白質(zhì)容易吸附在管壁上尤其是堿性蛋白質(zhì)的
靜電吸附最為突出這樣使毛細(xì)管電泳的分離效率下降峰高降低甚至不出峰為克服蛋白吸附常采用化學(xué)方法來消除或覆蓋管壁上的硅羥基使石英表面轉(zhuǎn)化成高分子涂層[18] Cunico等通過改性劑使毛細(xì)管柱內(nèi)壁帶正電荷電滲流從通常的正極到負(fù)極方向變?yōu)樨?fù)極到正極方向減少了蛋白在毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附同時也提高了分離度[19]
3.3 分光光度法
自從1960 年Satake 等介紹用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法測定蛋蛋白質(zhì)氨基濃度以來該方法已成為測蛋白質(zhì)修飾度最常用的方法TNBS 與蛋白質(zhì)反應(yīng)蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基的氨基末端進(jìn)攻TNBS 的磺酸基并將其取代形成的復(fù)合物有特定的光吸收以此測定其含量。
該方法簡單易行因此得到廣泛應(yīng)用但該方法存在如下缺陷(1)TNBS 與蛋白質(zhì)反應(yīng)受pH 影響較大所以實驗前應(yīng)先測定佳pH (2)對于較小的蛋白質(zhì)該方法精確度不高但Snyder 等在此基礎(chǔ)上對TNBS 法進(jìn)行改造使該法精確性又有所提高[20]Stock 等采用熒光胺法測定修飾度熒光胺與蛋白質(zhì)賴氨酸殘基的氨基末端發(fā)生反應(yīng)生成的產(chǎn)物有特定的光吸收通過測定蛋白質(zhì)混合物所激發(fā)的熒光值來測定其平均修飾度該方法靈敏性很高僅需納克級的蛋白質(zhì)就能完成但這類方法所用的PEG 衍生物較昂貴不適于常規(guī)分析[21]
3.4 其它方法
質(zhì)譜法是測定物質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要手段近年來一種新型的質(zhì)譜方法-基體輔助激光解析電離質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization MS, MALDI-MS)被成功地用于PEG 修飾蛋白組分的定性與定量分析該質(zhì)譜最大特點是可以分析高分子量的生物大分子被測分子量可達(dá)50 萬道爾頓紅外光譜也是鑒別化合物確定分子結(jié)構(gòu)常用的手段之一對單一組分或混合物中各組分也可以進(jìn)行定量分析由于拉曼散射光的頻率位移對應(yīng)于分子的能級躍遷因此拉曼光譜也成為人們研究分子結(jié)構(gòu)新的手段之一Bullock 等報道紅外光譜測定相對而言較為快速直接不需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理可以根據(jù)C O C 鍵的吸收強(qiáng)度給聚乙二醇定量但必須假設(shè)連接了SOD 和沒有連接SOD 的聚乙二醇的C O C 鍵的吸收強(qiáng)度相同另外由于紅外光譜對PEG-SOD 中的PEG 沒有特征吸收所以游離PEG 的量需要用GPC 法檢測并扣除而且該方法確定修飾度還需要知道精確的蛋白質(zhì)含量這也可能成為誤差來源拉曼光譜樣品制作簡單檢驗靈敏但同紅外光譜有相同的缺點MALDI-MS 光譜與毛細(xì)管電泳譜十分相似但精確性比毛細(xì)管電泳差而且與紅外光譜和拉曼光譜有同樣的缺點[16]
PEG 修飾技術(shù)在蛋白質(zhì)藥物的應(yīng)用上起著越來越重要的作用目前已上市的藥物有Enzon和Rhone-Poulenc Rorer 公司的抗癌藥Oncaspar(PEG-L-ASP 天冬酰胺酶) 羅氏公司治療丙肝病毒的PEG-Intron(PEG-IFN-a-2a) 已獲FDA 批準(zhǔn)用于多種嚴(yán)重免疫缺陷治療的PEG-ADA(腺苷脫氨酶) 還有PEG-水蛭素等多種藥物正處于臨床實驗階段針對不同的酶多肽或蛋白選擇適宜的PEG 活化和偶聯(lián)方式以及相應(yīng)的產(chǎn)物分離與檢測方法各種方法都有其適用范圍和局限性至今還沒有通用的方法可供選擇隨著PEG 修飾技術(shù)研究的不斷深入各種修飾特異性好修飾率高操作簡便偶聯(lián)產(chǎn)物穩(wěn)定的活化劑不斷涌現(xiàn)必將進(jìn)一步提高聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的特異性從而使產(chǎn)物的分離純化和分析檢測更加簡單易行這是PEG 修飾技術(shù)發(fā)展的必然要求。